EndoNUclease Heteroduplex Cleavage typing (ENUHCT) : une technique universelle de typage avec concept de preuve sur la détection des variants de spike du SARS-CoV-2

INTRODUCTION: Le rôle épidémiologique et clinique des variants SARS-CoV-2 a démontré la nécessité de techniques d’identification rapide à partir des prélèvements cliniques. Nous avons développé une technique de typage par clivage endonucléasique des hétéroduplexes (ENUHCT). Elle repose sur le mélange de deux produits PCR (une référence et un échantillon à étudier). Après dénaturation et réhybridation, on obtient des homoduplex (Ref/Ref, Var/Var) et potentiellement des hétéroduplex (Ref/Var). La nucléase clive les heteroduplex créant des fragments de taille différente selon le nombre et la position des mutations. Par électrophorèse capillaire, il est facile de détecter la présence de mutation(s) selon le nombre et à la taille des fragments. MATÉRIELS ET MÉTHODES: La preuve de concept a été réalisée avec des souches virales (https://www.european-virus-archive.com/) cultivées en cellules Vero-E6 dans un laboratoire NSB3. Les extraits d’acides nucléiques correspondant à 500 prélèvements cliniques identifiés par séquençage ont été étudiés après codage aveugle. Amplification PCR : les primers sens (TTACCAGATGATTTTACAGGC) et reverse (AGACTTTAGGTCCACAAAC) [400 nm] amplifient un fragment de 303 pb sous 25-μL avec 12,5 μL de 2X Reaction Mix, 0,5 μL de Superscript II RT/Platinum Taq Mix et 5 μL d’ARN de culture ou 3 μL d’ARN provenant d’échantillons biologiques (30 min/50 °C–2 min/94 °C, puis 40 fois 15 s/94 °C–20 s/55 °C–20 s/68 °C, puis 2 min/72 °C). Mismatch detection : les 2 produits de PCR sont mélangés vol/vol. Après dénaturation/hybridation, les réactifs du Kit SURVEYOR (IDT) sont ajoutés suivant le protocole et incubés pendant 1 heure à 42 °C. Capillary electrophoresis : l’analyse des fragments est faite par électrophorèse capillaire (Caliper GXII) sur puce ADNerkinElmer avec LabChip GX Reviewer. Sanger sequencing : les produits de PCR ont été séquencés par Genewiz. RÉSULTATS: Les résultats obtenus sont en parfaite correspondance avec les résultats théoriques. En associant une souche européenne avec variant UK on obtient 2 fragments (231/72 pb [mismatch en 501]) ; en associant variant UK et variant SA (180/123 pb [mismatch en 484]) ; en associant souche européenne et variant SA on obtient 4 fragments (180/123/72/51 [mismatch en 484 et 501]). De même, les résultats obtenus avec les prélèvements cliniques nous ont permis d’identifier correctement les variants connus et d’identifier de nouveaux variants. Ces derniers ont été confirmés par séquençage. CONCLUSION: ENUHCT : – est simple, sensible, peu coûteuse ; – permet de détecter les variants reconnus et de découvrir des variants encore non répertoriés ; – peut être appliquée à d’autres microorganismes ; – permet de typer plus de 1000 échantillons par jour.